油菜素內酯檢測小結

油菜素內酯是一種內源的甾醇類化合物,含有四環骨架,是一個疏水的、中性的物質,分子中只有少數羥基基團是極性部分。在被子植物的花粉、花藥、種子、葉片、莖、根及幼嫩的生長組織中都含有低濃度的油菜素內酯。其合成前體CS也具有生物活性,因此也被認為是一種油菜素類酯類激素。
由于它極性基團少,使得它難以在傳統的液質聯用的ESI離子源中被離子化。而由于A環上有羥基基團,D環上有側鏈。其22,23位的羥基側鏈使得其被衍生化為易電離的物質成為可能。常用含氮硼酸化合物進行衍生化,硼酸部分可以在溫和條件下與BRs的鄰位二醇官能團發生共價反應,當用ESI-MS分析時,衍生物的含氮官能團給予BR化合物增強的電離效率。

油菜素內酯

雖然BRs的MS響應可以通過衍生化來提高,但是由于植物樣品基質效應的復雜性,在實際植物材料中檢測BRs還是不夠的。在常規的SPE,HPLC分離后基質抑制作用依然存在。因此應該開發BR化合物的高效純化方案以盡可能地去除天然存在的對植物粗提物的干擾。通常,凈化過程由多個處理步驟組成,這將導致目標分子的回收率降低,所以在實際植物樣品中保持BRs的干擾消除和回收之間的平衡是至關重要的。另外,植物提取物中復雜的可電離代謝物的出現將進一步抑制MS的ESI源中BRs的電離,并影響BRs的檢測靈敏度。因此,新的凈化策略應考慮減少或消除所有可電離的代謝物,并消除這些干擾的負面影響。通過樣品預處理,痕量目標分子可以被富集,并且一些可能的污染物干擾檢測可以從基質中去除。由于BL在植物中含量非常低(pg至ng級別),而植物樣品基質又十分復雜,因此檢測它需要高效率的前處理方法,高靈敏度-高分辨率的檢測方式。

野生型和常規型各器官BL等化合物含量
各器官內源性物質的等級

油菜素類酯的結構特點:

油菜素類酯的結構特點

結構特點:A環與B環為反式構型,這是由于C-5上的α氫決定的;
B環結構中含有6-氧或6-氧-7-氧雜環基團。盡管B環上有限修飾不會使活性喪失,但是會導致活性顯著下降。如CS上的B環(7位沒有氧)。
A環的C-2,C-3位的羥基應當是順式α向。其中任一改變都會使得活性喪失。
側鏈22位,23位有羥基。
側鏈24位的基團可能有變化(如24-BL,28-HomoBL),會導致一定程度的活性降低。

BL/CS分子結構式

傳統的檢測手段:
植物研磨成粉末后以甲醇/氯仿萃取,再以水/氯仿分層,而后以硅膠柱收集有機相中的BR,再以Sephadex LH-20 小柱和Sep-Pak Plus C18小柱聯合凈化。
缺點:3-4天,過于繁瑣的步驟,回收率低,不適合提取CS等物質。

我們現在的方法(參考Feifeng Huo,2012 talanta):
80%甲醇,過Bond Elut Plexa SPE小柱加strata-X小柱。
特點:2-3天,回收率較高,但對CS類物質回收率仍不夠高。

我們將會采用的新方法:
95%甲醇提取,MAX小柱聯合PCX小柱凈化,輔以QuEChERS凈化(MAX小柱,吸附酸性干擾物;MCX小柱,去除親水干擾物和極疏水干擾物)。DMAPBA衍生化。
1-2天,回收率較高,適用于CS類物質。

關于油菜素內酯檢測的常見問題:

Q:油菜素內酯,油菜素淄醇,BR,BL,24-epiBL,28-homoBL都是什么?我們應該測哪種更有意義?
A:油菜素甾醇brassinosteroids (BRs)是一類甾醇類的,有一個四元環的植物內源激素。其活性最高,研究也最廣泛的是brassinolide(BL),也就是我們常稱的油菜素內酯,在有些文獻中也會把它簡稱為BR,另外由于其較為出名,也有人稱該類激素為油菜素類酯類。24-epiBL為BL在C-24位上的順反異構體,28-homoBL是C-28位上增加的額外的甲基。
一般來說BL是該類激素中活性最高的物質,檢測其最有意義,但是其含量在大多數植物器官中都不高。24-epiBL,28-homoBL活性較低,但是在一些植物中含量稍高(但是我們沒有買到標準品)。CS(castasterone),5-Deoxo-CS(5-Deoxo- castasterone)是油菜素類酯的合成前體,有一定生物活性且含量較高,其中CS是BL合成的多種通路中的必經前體。此外還有TE、TY等合成前體,不過我們都買不到標準品(似乎只有加拿大一家公司做,不過那個公司關門了,我們通常聯系的Olchenm等國外廠家沒有)。我們已經訂購了CS、5-Deoxo-CS的標準品,在3月后會推廣這兩個物質的檢測,同時我們也訂購了BL的內標物,以后油菜素類酯也可以以內標法檢測。

Q:為什么BR不能與其他激素一起檢測?
A:油菜素類酯在植物中含量很低(pg至ng級別,屬于超痕量),同時極性很弱,在ESI離子源中難以電離。因此對于它的前處理其一是要富集植物中的待測物,其二是不僅僅要去除樣品中大量的此生代謝物,也要去掉其中其它微量、痕量的物質,以減少其它易電離物質對其檢測的干擾。這其中就包括了其他的激素類物質。
而如果用常規激素檢測的前處理方法來處理BL,會殘留大量雜質,由于基質效應影響對BL檢測造成干擾,降低BL的檢測效率。

Q:為什么價格比其他激素要高?
A:固相萃取小柱的耗材成本,更長的實驗周期,更昂貴的標準品,需要更熟練的員工,前期研發的實驗成本等。(微信咨詢:密碼子謝鵬 15837171623  ,信息來源zoonbio)